Phim khắc họa một bức tranh nông thôn sống động, chân thực. Nội dung phim không chỉ mang đến cho khán giả những tiếng cười mà còn truyền tải những bài học quý giá về cuộc sống, khơi dậy sự lạc quan trong mỗi người.
Vui lên nào anh em ơi xoay quanh hành trình khởi nghiệp đầy gian nan nhưng không kém phần hài hước, thú vị của nhóm bạn đồng niên Tiến (Anh Đức), Thắng (Thái Sơn) và Hưng (Tô Dũng). Họ lớn lên bên nhau và cùng quyết tâm bám trụ làm giàu ở vùng quê nghèo. Song khởi nghiệp lần thứ n mà kết quả chẳng khác gì lần đầu đã dần giúp 3 chàng trai nhận ra, bản thân họ có những thiếu sót, và ánh nhìn của mọi người với mình không hẳn là định kiến. Cả 3 quyết tâm cùng nhau gây dựng sự nghiệp, công danh để chứng minh giá trị "với đời".
Hành trình thay đổi từ một nhóm "đàn ông thiếu trưởng thành" không có lý tưởng, đến những người có ý thức trách nhiệm, có khao khát là một hành trình gian nan mà ở đó người muốn thay đổi mang đầy cực nhọc, uẩn ức và cũng không ít lần nản lòng, thoái chí. Cũng may, bên cạnh họ vẫn còn những người phụ nữ luôn kề vai sát cánh. Đó là Thu, cô vợ thực dụng, chua ngoa nhưng yêu chồng thương con của Tiến; hay Nhung, mê tiền, khéo miệng nhưng hào sáng, trượng nghĩa...
Bộ phim cũng khẳng định giá trị bản thân, sức mạnh của tình bạn, đồng thời cũng khẳng định giá trị của niềm tin, của sự khích lệ, của lối sống tích cực, cái nhìn văn minh của mỗi người đối với những người xung quanh, cộng đồng và xã hội. Các tình huống trong phim không bi lụy, nặng nề mà tươi sáng, nhẹ nhàng, các sự kiện được giải quyết nhanh gọn, liên tục nhằm mang lại cho khán giả một bộ phim có màu sắc tươi vui.